In silico und in vivo hepatoprotektive Aktivität des synthetisierten 5

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4681 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In der vorliegenden Studie wurde die hepatoprotektive Wirkung von 5-Benzylidin-2-thiohydantoin (5B2T), einem einzigartigen Derivat der Thiohydantoingruppe, auf durch Diethylnitrosamin (DEN) induzierte Leberschäden bei männlichen Ratten untersucht. Die Versuchstiere wurden in drei Gruppen zu je 14 Ratten eingeteilt. Ratten in Gruppe I galten als Kontrollen und erhielten nur 10 % Tween 80. Ratten in Gruppe II wurden 200 mg/kg DEN intraperitoneal injiziert. Ratten in Gruppe III wurde eine Einzeldosis 200 mg/kg DEN intraperitoneal injiziert und sie erhielten die Behandlung oral (50 mg/kg, 5B2T) über zwei Zeiträume, 3 und 6 Wochen. Am Ende des Experiments wurde Blut zur Analyse der Leberfunktion und der Spiegel des proinflammatorischen Zytokins IL-6 und des Tumornekrosefaktors α (TNF-α) entnommen. Darüber hinaus wurden Leberproben für histopathologische Untersuchungen und Immunhistochemie verwendet. Die einmalige intraperitoneale Injektion von 200 mg/kg DEN bei Ratten führte zu einem signifikanten Anstieg der Serumenzymspiegel von AST, ALT und ALP, die Indikatoren für hepatozelluläre Schäden sind, zusammen mit einem Anstieg von TNF-α und IL-6 in der DEN-Gruppe. Die Ergebnisse sowohl der LFTs als auch des ELISA in der Behandlungsgruppe zeigten Verbesserungen und einen Rückgang der Markerwerte. Die histopathologische Untersuchung zeigte Fibrose, Nekrose und Infiltration von Entzündungszellen in der DEN-Gruppe, mit geringerer Intensität in der Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung zeigten eine starke positive Färbung sowohl der HSA- als auch der Ki-67-Antikörper in der DEN-Gruppe, mit einer viel geringeren Intensität in der Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse der Docking-Studie zeigten, dass 5B2T eine bemerkenswerte Wechselwirkung mit TNF-α (PDB-ID: 1TNF) und menschlichem IL-6 (PDB-ID: 1IL6) mit Bindungsstellenenergien von – 7,1 und – 6,1 (kcal/mol) aufweist. jeweils. Die korrekte Absorption und Bindung zwischen dem Arzneimittel und dem Rezeptor wurde durch computergestütztes molekulares Docking mithilfe des AutoDock-Programms bewertet. Die Schlussfolgerung der Ergebnisse der aktuellen Studie spiegelt die interessanten hepatoprotektiven Fähigkeiten von 5B2T gegen DEN-induzierte hepatozelluläre Schäden und Krebs bei Versuchsratten wider.

Leberkrebs ist weltweit eine der häufigsten und schwerwiegendsten bösartigen Erkrankungen mit schnellem Wachstum und schlechter Prognose. Leberkrebs kann als normale Leberschädigung beginnen, die sich zu einer Fibrose entwickelt und dann zu einer Zirrhose fortschreiten und in einem kritischen Fall eines Karzinoms enden kann1. Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC), einfach Leberkrebs genannt, ist eine tödliche Krebsart mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten. Ein Grund, warum die Diagnose von Leberkrebs schwierig ist, liegt darin, dass er bis zum Erreichen entwickelter Stadien asymptomatisch ist2. Das hepatozelluläre Karzinom besteht aus bösartigen neoplastischen Zellen, die größtenteils wie Hepatozyten aussehen und sich mit der Differenzierung verändern3. Die Leber ist das größte innere Organ und für die Ausführung vieler lebenswichtiger Aktivitäten verantwortlich, beispielsweise für die Beseitigung interner und externer biologischer Abfallstoffe und Stoffwechselabfälle (z. B. Galle, Harnstoff und Lipide) aus dem Blutkreislauf . Darüber hinaus spielt es eine sehr wichtige Rolle bei vielen Funktionen des Immunsystems4. Die Inzidenz hepatozellulärer Karzinome nimmt derzeit sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern aufgrund der hohen Rate an Virusinfektionen (z. B. HBV, HCV und HDV), Alkoholismus und Fettleibigkeit zu5.

Nitrosamine sind eine Gruppe giftiger chemischer Verbindungen, die sowohl für Menschen als auch für Tiere als sehr wirksam, giftig und krebserregend gelten6. N-Nitroso-Alkylverbindungen, insbesondere Diethylnitrosamin (DEN), können verschiedene Arten und Stadien von bösartigen Erkrankungen in verschiedenen Organen, einschließlich Leber, Lunge und Blut, auslösen und werden häufig als Auslöserchemikalien zur Förderung von Krebs bei Versuchstieren (am häufigsten Ratten) eingesetzt. 7. Diethylnitrosamine waren bisher als Konservierungsmittel für viele Lebensmittel etabliert, etwa für Milchprodukte, geräucherten und gesalzenen Fisch und Fleisch, Sojabohnen und alkoholische Getränke. In der Lebensmittelindustrie werden einige Chemikalien als mikrobielle Wachstumshemmer, Konservierungsmittel, Farbstoffe und Geschmacksstabilisatoren zugesetzt. Am bekanntesten ist die Verwendung von Nitriten. Nitrite werden unter dem Einfluss hoher Temperaturen und Magensäure in Nitrosamine umgewandelt. Das Endergebnis ist, dass diese Art von Lebensmitteln eine Hauptquelle dieser giftigen Stoffe darstellt, weshalb diese Chemikalien nicht mehr als Konservierungsmittel in der Lebensmittelverarbeitung verwendet werden8. Hydantoine (auch bekannt als Glykolylharnstoffe, entstehen durch die Reaktion von Glykolsäure und Harnstoff) und ihre Derivate (und einige andere Moleküle) sind eine Gruppe heterozyklischer Verbindungen (organisch) und gelten als sehr wichtige und lebenswichtige Chemikalien, weil sie spielen in vielen biologischen und pharmakologischen Ansätzen sowie in der medizinischen Chemie und in agrochemischen Anwendungen eine zentrale Rolle. Darüber hinaus stellen sie die wichtigsten Vorläufer für die chemische und enzymatische Synthese vieler wichtiger nichtnatürlicher Alpha-Aminosäuren und ihrer Konjugate dar von medizinischer Bedeutung. Hydantoin ist ein farbloser Feststoff und ein Derivat der Oxidation von Imidazolidin; es trägt die Formel C3H4N2O29. Thiohydantoine und ihre Derivate stehen heutzutage aufgrund ihres hohen bioaktiven und therapeutischen Potenzials im Mittelpunkt des Interesses von Wissenschaftlern und Forschern. Thiohydantoin ist ein Schwefelanalogon (S oder Thio) der Verbindung Hydantoin (auch bekannt als Imidazolidin-2,4-dione), bei dem eine oder zwei Carbonylgruppen durch Thiocarbonylgruppen ersetzt sind10. Eine interessante Tatsache bei dieser Gruppe von Molekülen ist, dass ihre biologische Aktivität je nach Art der Substituenten verändert und beeinflusst wird. Eine beträchtliche Anzahl von Thiohydantoin-Derivaten kann klassisch durch Kondensationsreaktionen verschiedener Aldehyde hergestellt werden11,12. Zu den wichtigsten biologischen Anwendungen, therapeutischen Aktivitäten und pharmakologischen Zwecken dieser Klasse heterozyklischer Verbindungen gehören Antitumoraktivität, antibakterielle Aktivität, antiparasitäre Aktivität, antimalariaaktive Aktivität, antimykotische Aktivität, Antiepilepsieaktivität, anti- Melanogeneseaktivität10. Es ist interessant, die Entstehung des Thiohydantoinrings als effizienten pharmakophoren Bestandteil bei der Entwicklung wirksamer Inhibitoren für EGFR- und VEGFR-Wachstumsfaktorrezeptoren zu beobachten. Darüber hinaus sind Thiohydantoin-Derivate Androgenrezeptor- und TNF-Antagonisten sowie wirksame Inhibitoren mehrerer Enzyme, darunter DNA-Topoisomerase I, II (TopI, II), NOXs, Isocitratdehydrogenasen (IDHs), B-Zell-Lymphom-2 (Bcl- 2) und Sirtuine (SIRTs), Kinesin-Spindelprotein (KSP), Prolylhydroxylasen 1–3 (PHD 1–3), CDK2 und CDK4.11,25. Ziel der vorliegenden Studie war es, die hepatoprotektive Wirkung des neuen Thiohydantoin-Derivats 5-Benzylidin-2-thiohyadantoin (5B2T) in einem Rattenmodell für DEN-induzierte Leberschäden zu testen.

Für die vorliegende Studie wurde ein neu synthetisiertes Derivat von Thiohydantoin, 5B2T, experimentell im Labor hergestellt und als Medikament zur Behandlung von Leberschäden eingesetzt.

Alle Schmelzpunkte der Verbindungen wurden mit einem Griffin-Gerät bestimmt. Infrarotspektren wurden im Bereich 4000–600/cm mit einem FTIR-Instrument der SHIMADZU CORP-Serie aufgezeichnet. Die NMR-Spektren wurden mit einem Bruker DPX 400 (400 MHz)-Spektrometer unter Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als internem Standard durchgeführt. Chemische Verschiebungen wurden in ppm (δ) bezogen auf TMS (0,00) ppm gemessen. Sofern nicht anders angegeben, wurden hochauflösende massenspektrometrische Daten im Elektrospray-Modus (ES) auf einem Waters Q-TOF-Mikromassenspektrometer unter Verwendung eines Gilson 232XL-Autosamplers erhalten.

Handelsübliches 2-Thiohydantoin wurde mit den benötigten Aldehyden in einem Rundkolben, der mit einem Magnetrührer und einem Rückflusskühler ausgestattet war, unter einer Stickstoffatmosphäre in Triethylamin und Wasser vorgelegt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und der pH-Wert durch Zugabe von 3 M HCl auf 3 eingestellt. Das feste Produkt wurde abfiltriert und mit Diethylether und Wasser gewaschen. Die reinen Verbindungen wurden gesammelt und getrocknet13.

5B2T (das Endprodukt) wurde unter Verwendung von handelsüblichem Hydantoin, gelöst in Ethanol, in Gegenwart von Benzaldehyd und Triethylamin und unter H2O-Rückfluss über Nacht synthetisiert (dies erfolgte nach dem Erfolg einer Testreaktion).

Zur Bestimmung der Sicherheit der neu synthetisierten Verbindung 5B2T wurden die OECD-423-Richtlinien befolgt, indem den Versuchsmäusen eine Einzeldosis von 2 g/kg und 5 g/kg verabreicht wurde14. Kurz gesagt, 36 gesunde Mäuse (18 Männer und 18 Frauen) wurden in drei Gruppen eingeteilt, die als Vehikel (dH2O), niedrige Dosis (2 g/kg) bzw. hohe Dosis (5 g/kg) von 5B2T gekennzeichnet waren. Jede Maus musste vor der Verabreichung eine Nacht lang fasten. Nach der Verabreichung wurde das Essen für weitere 3–4 Stunden zurückgehalten. Die Tiere wurden 30 Minuten lang sowie 2, 4, 24 und 48 Stunden nach der Verabreichung genau beobachtet, um Anzeichen akuter klinischer Toxizität, Morbidität und Mortalität festzustellen. Zu den Verhaltensbeobachtungen gehören: Atmung (Dyspenea), Speichelfluss, Piloerektion der Haut, Exophthalmus, Krämpfe und Veränderungen der Fortbewegung. Nachdem sie 14 Tage lang am Leben gehalten worden waren, wurden die Mäuse am 15. Tag getötet, um die biochemischen Serumparameter (Leber und Niere) nach den Standardmethoden zu messen15.

In dieser Studie wurden 42 gesunde erwachsene männliche Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 g und einem Durchschnittsalter zwischen 3 und 4 Monaten verwendet. Sie wurden von der Tierstation/College of Pharmacy/Hawler Medical University bezogen. Den Tieren wurde Standardfutter und Leitungswasser verabreicht. Die Tiere wurden gemäß den ethischen Grundsätzen des National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals16 mit Genehmigung der Ethikkommission des College of Pharmacy/Hawler Medical University (Nr. 2021.25.08-) behandelt und von Menschen versorgt. 205 HMU. PH. EC). Alle Methoden werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) gemeldet. Die Tiere wurden vor dem Experiment mindestens eine Woche lang bei 22 ± 3 °C in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit 50–60 % Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Ratten wurden in drei Gruppen eingeteilt (n = 12). Die Verabreichung der Dosierung erfolgte unter Berücksichtigung des Körpergewichts (BW) der Ratten. Gruppe I erhielt während des gesamten Experiments 10 % Tween 80 und wurde als Placebogruppe angesehen. Ratten in Gruppe II erhielten eine intraperitoneale Einzeldosis von 200 mg/kg6 DEN nach der Methode von Rezaie et al.6 und dienten als positive Kontrollgruppe für Leberschäden, während Ratten in Gruppe III 50 mg/kg 5B2T oral verabreicht bekamen Behandlung in zwei Perioden: Die erste Periode dauerte 3 Wochen und die zweite Periode dauerte 6 Wochen. Am Ende des Experiments wurden alle Ratten getötet und Blut für die biochemische Analyse und proinflammatorische Zytokinanalyse mittels ELISA gesammelt. Die Gewebe der entnommenen Lebern der Ratten wurden mit 10 % Formalin fixiert und anschließend einer Reihe von Hydratations- und Dehydratisierungsreaktionen unterzogen. Anschließend wurden sie eingebettet, geschnitten, verarbeitet und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen gefärbt und auf den Nachweis spezifischer Antikörper getestet, bei denen es sich um Kernprotein (Ki-67) und Hepatozyten-spezifisches Antigen (HSA) handelte.

Die zweidimensionalen (2-D) Strukturen der Ligandenmoleküle (Abb. 1) wurden mit Chemdraw Professional 16.0 erstellt und mit dem Chem3D 16.0-Modul in dreidimensionale (3-D) Strukturen umgewandelt und als Strukturen im PDF-Format gespeichert (http ://www.cambridgesoft.com/). Der Ligand wurde durch Hinzufügen von Geister-Ladungen und Wasserstoff optimiert und das pdbqt-Format der Liganden wurde mit AutoDock Tools 1.5.7 erstellt.

5-Benzylidin-2-thiohydantoin.

Die Ligandenmoleküle wurden dann als Input für AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) verwendet, um die Docking-Simulation durchzuführen.

Die Röntgenkristallstruktur des Ziels des Nekrosefaktors TNF-α (PDB-ID: 1TNF) und des menschlichen Interleukin-6 IL-6 (PDB-ID: 1IL6) wurde vom Webserver der RCSB Protein Data Bank (http://) abgerufen. www.rcsb.org/pdb/). Die aktiven Bindungsstellen wurden mit Discovery Studio Visualizer 2021 identifiziert. Die Rasterabmessungen wurden entsprechend den Koordinaten x, y auf 8,41 × 64,05 × 31,20 (PDB-ID: 1TNF) und 3,49 × − 3,45 × 0,44 (PDB-ID: 1IL6) festgelegt , und z, für die aktiven Zielbindungsstellen, die im Discovery Studio Visualizer 2021 identifiziert wurden. Die Wassermoleküle wurden von den Rezeptoren entfernt und polarer Wasserstoff und Kollman-Ladungen wurden hinzugefügt. Das pdbqt-Format der Rezeptoren wurde von AutoDock Tools 1.5.7 generiert. AutoDock Vina wurde kompiliert und läuft unter dem Betriebssystem Windows 10.0 Professional. Mit Discovery Studio 2021 wurde die bildliche Darstellung der Interaktion zwischen den Liganden und dem Zielprotein abgeleitet.

Die Bindungsaffinität (ki) von Liganden für ausgewählte Ziele wurde berechnet und unter Verwendung von Gleichung bewertet. (1)

Dabei ist \(\Delta G\) die Bindungsenergie in kcal/mol, die universelle Gaskonstante R = 1,987 kcal/K/mol, bei Raumtemperatur (25 °C) T = 273 + 25 = 298 K. Ki ist die Hemmungskonstante, wobei der Ki hauptsächlich von der Bindungs- (oder Assoziations-)Konstante (Kb) mit der Einheit mM17 abhängt.

Die Vorhersage pharmakokinetischer und physikalisch-chemischer Parameter spielt eine Schlüsselrolle bei der Arzneimittelentwicklung18. Die Bewertung der arzneimittelähnlichen Eigenschaften wurde für 5BT mithilfe von SwissADME (http://www.swissadme.ch/) und admetSAR (http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2) evaluiert.19 Ein arzneimittelähnliches Molekül muss sein Befolgen Sie die Fünferregel von Lipinski (RO5): Das Molekulargewicht MW des aktiven oralen Arzneimittels sollte ≤ 500 Da sein; der log p sollte < 5 sein; die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren sollte nOH ≤ 10 sein; die Anzahl der Wasserstoffbrückendonoren nOHNH sollte ≤ 5 sein; und die Anzahl der drehbaren Bindungen sollte ≤ 1020 sein.

Unter Verwendung der im Abschnitt „Materialien und Methoden“ genannten Herstellungsmethode wurden Thiohydantoin (2,0 g, 17,2 mmol), Trimethylamin (4,9 ml, 37 mmol) und Benzaldehyd (1,9 ml, 19 mmol) zu 50 ml Wasser gegeben. Ausbeute = 69,9 %, Schmp. 270–272 °C, HRMS berechnet für C10H8N2OS m/z [M + H] + 204,0358; gefunden 204.0358; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12,41 (s, H, NH), δ 12,19 (s, H, NH), δ7,74 (d, J = 7,4 Hz, 2H, phen), δ 7,45 –7,37 (m, 3H, Phenyl), δ 6,49 (s, H, CH=C). 13C-NMR (101 MHz, d6-DMSO): δ 177,3 (C=S), δ 164,0 (CO), δ 130,5 (C=CH), δ 128,6 (2xCH), δ 127,3 (C), δ 127,0 (2xCH ), δ 126,0 (CH), δ 109,7 (CH=C). IR (unverdünnt): vmax = 3225/cm (NH), 1723 cm-1 (C=O), 1475/cm (C=S), 1643/cm (C=C).

Die mit hohen Dosen (2 g/kg und 5 g/kg) 5B2T behandelten Versuchsmäuse blieben 14 Tage lang in aktivem, gesundem Zustand am Leben und es gab keine offensichtlichen Anzeichen einer Toxizität und es wurden keine Todesfälle registriert. Die Ergebnisse der biochemischen Bluttests zeigten keinen Unterschied zwischen den behandelten Gruppen und der Kontrollgruppe, wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, was darauf hindeutet, dass 5B2T bei oraler Verabreichung sicher war und die tödliche Dosis (LD50) für beide Geschlechter mehr als 5 g betrug /kg.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie (Abb. 2) zeigten, dass die Verabreichung von DEN in der ersten Gruppe (DEN-behandelte Ratten) zu einem signifikanten Anstieg der biochemischen Parameter führte, während die Behandlung mit 5B2T zu einem deutlichen Rückgang derselben biochemischen Marker führte. Gleichzeitig spiegelten die ELISA-Ergebnisse einen signifikanten Anstieg der proinflammatorischen Zytokine (TNF-α und IL-6) bei mit DEN behandelten Ratten und insbesondere niedrigere Werte derselben Zytokine bei mit 5B2T behandelten Ratten wider (Abb. 3).

Die Wirkung von 5B2T auf die biochemischen Parameter der Leber. Auf der X-Achse sind die Behandlungsgruppen und auf der Y-Achse die Leberfunktionsparameter dargestellt, DEN: Diethylnitrosamin, T: 10 % zwischen 80, 5B2T: Behandlungsgruppe. AST: Acetataminotransferase, ALT: Alaninaminotransferase, ALP: alkalische Phosphatase.

Die Wirkung von 5B2T auf die proinflammatorischen Zytokinspiegel TNF-α und IL-6. Auf der X-Achse sind die Behandlungsgruppen und auf der Y-Achse die Zytokinspiegel dargestellt, DEN: Diethylnitrosamin, T: 10 % zwischen 80, 5B2T: Behandlungsgruppe. TNFα: Tumornekrosefaktor Alpha und IL-6: Interleukin 6.

Die histopathologische Untersuchung der Leberschnitte der mit Placebo (10 % Tween 80) behandelten Ratten zeigte für beide Zeiträume (3 Wochen und 6 Wochen) völlig normale histologische Merkmale (Abb. 4A und B). Die 3-wöchige Verabreichung von DEN zeigte deutlich sichtbare Leberschäden, die sich in einer massiven Entstellung der Leberstruktur, einer Erweiterung der Sinusoiden und einer massiven Fibrose im Pfortaderbereich äußerten (Abb. 4C). Die sechswöchige Verabreichung von DEN führte wiederum zu massiven abnormalen histologischen Merkmalen der Leberabschnitte, begleitet von einer Infiltration von Entzündungszellen im Bereich der Zentralvene, was ein Indikator für eine Entzündung und ein fortgeschrittenes Stadium einer Leberschädigung ist. Darüber hinaus wurde eine Erweiterung der Gallenkanäle sowie eine Leberpeliose und ein Adenom festgestellt (Abb. 4D). Mit DEN und 5B2T behandelte Ratten zeigten für beide Zeiträume (3 und 6 Wochen) dramatische Verbesserungen im histopathologischen Erscheinungsbild der getesteten Leberschnitte (Abb. 4E und F).

Leberschnitt, H&E. 400×. (A) Placebogruppe/3 Wochen, zeigt normale histologische Merkmale der Leberstränge (schwarzer Pfeil) und der Zentralvene (blauer Pfeil). (B) Placebo-Gruppe/6 Wochen, zeigt normale histologische Merkmale der Blutgefäße im Pfortaderbereich (schwarzer Pfeil) und der Gallencuniculi (blauer Pfeil) sowie der Hepatozyten (roter Pfeil). (C) DEN-Gruppe/3 Wochen, zeigt Fibrose um den Portalbereich (schwarzer Pfeil), Hyperplasie der Kupffer-Zellen (blauer Pfeil) und Erweiterung der Sinusoide (roter Pfeil). (D) DEN-Gruppe/6 Wochen, zeigt hepatozelluläres Adenom (schwarzer Pfeil), Hyperplasie der Kupffer-Zellen (blauer Pfeil), vakuoläre Degeneration (roter Pfeil), koagulative Nekrose (violetter Pfeil) mit Erweiterung der Sinusoide (grüner Pfeil). (E) 5B2T-Gruppe/3 Wochen, zeigt Hyperplasie der Gallencuniculi (schwarzer Pfeil), nekrotische Hepatozyten (blauer Pfeil) und Infiltration von Entzündungszellen (roter Pfeil). (F) 5B2T-Gruppe/6 Wochen, zeigt eine leichte Peliose (blauer Pfeil) und wenige Hepatozyten zeigten eine Zelldegeneration (roter Pfeil).

Die immunhistochemischen Veränderungen wurden durch Screening der Expression von zwei Lebermarkern bewertet: Ki-67 und HSA. Die Ergebnisse der Placebogruppe (Gruppe I) zeigten eine negative Färbung mit Ki-67-Antikörpern im Kern der Hepatozyten nach 3 und 6 Wochen (Abb. 5A und B). Im Gegensatz dazu zeigten die mit DEN behandelten Ratten (Gruppe II) im ersten und zweiten Zeitraum eine positive Färbung mit Ki-67-Antikörpern in den betroffenen Hepatozyten, und die betroffenen Zellkerne waren dunkelbraun gefärbt (Abb. 5C und D). Die gefärbten histologischen Leberschnitte von mit 5B2T behandelten Ratten (Gruppe III) zeigten für die erste Dauer (3 Wochen) eine schwach positive Färbung mit Ki-67-Antikörpern im Zytoplasma der betroffenen Hepatozyten als goldbraune Körnchen; Andererseits zeigten histologische Schnitte von Ratten für die zweite Dauer (6 Wochen) eine schwach positive Färbung mit Ki-67-Antikörpern im Zytoplasma der verletzten Leberzellen und ein goldbraunes Körnchenbild (Abb. 5E und F). Darüber hinaus zeigten die Schnitte der mit 10 % Tween 80 behandelten Ratten (Gruppe I) für die erste und zweite Dauer eine negative Färbung mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma der Hepatozyten (Abb. 6A und B). Die histologischen Schnitte von mit DEN behandelten Ratten (Gruppe II) zeigten eine starke positive Färbung mit HSA-Antikörpern in den betroffenen Hepatozyten, die sich im ersten und zweiten Zeitraum als goldbraune zytoplasmatische Körnchen verfärbten, und die betroffenen Zellkerne waren dunkelbraun gefärbt (Abb . 6C und D). Die gefärbten hepatischen histologischen Schnitte der mit 5B2T behandelten Ratten (Gruppe III) zeigten in der ersten Versuchsdauer (3 Wochen) eine schwach positive Färbung mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma der betroffenen Hepatozyten als goldbraune Körnchen; Andererseits zeigten histologische Schnitte für die zweite Dauer (6 Wochen) eine schwach positive Färbung mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma der verletzten Leberzellen mit goldbraunem Granulat-Erscheinungsbild (Abb. 6E und F).

Leberschnitt, IHC Ki67 -ab. 400×. (A) Placebogruppe/3 Wochen, zeigt negative Färbung mit Ki67-Antikörpern im Kern der Hepatozyten (roter Pfeil). (B) Placebogruppe/6 Wochen, zeigt negative Färbung mit Ki67-Antikörpern im Kern der Hepatozyten (roter Pfeil). (C) DEN-Gruppe/3 Wochen, zeigt positive Färbung mit Ki67-Antikörpern in den betroffenen Hepatozyten, die den Zellkern dunkelbraun färbten (roter Pfeil), unspezifische Färbung in anderen Zellelementen zu erkennen (schwarzer Pfeil). (D) DEN-Gruppe/6 Wochen, zeigt eine positive Färbung mit Ki67-Antikörpern in den betroffenen Hepatozyten, die den Zellkern dunkelbraun färbten (roter Pfeil). (E) 5B2T-Gruppe/3 Wochen, zeigt wenige positiv färbende Hepatozytenkerne mit Ki67-Antikörpern (roter Pfeil). (F) 5B2T-Gruppe/6 Wochen, zeigt negativ gefärbte Kerne von Hepatozyten mit Ki67-Antikörpern (roter Pfeil).

Leberschnitt, IHC HSA -ab. 400×. (A) Placebogruppe/3 Wochen, zeigt negative Färbung mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma von Hepatozyten (roter Pfeil). (B) Placebo-Gruppe/6 Wochen, zeigt negative Färbung mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma von Hepatozyten (roter Pfeil). (C) DEN/3 Wochen, zeigt eine starke positive Färbung mit HSA-Antikörpern in den betroffenen Hepatozyten, die sich als zytoplasmatische goldene Muskelkörner verfärbten (roter Pfeil), unspezifische Färbung in anderen Hepatozyten zu erkennen (schwarzer Pfeil). (D) DEN-Gruppe/6 Wochen, zeigt eine starke positive Färbung mit HSA-Antikörpern in den betroffenen Hepatozyten, die sich als zytoplasmatische goldene Muskelkörner verfärbten (roter Pfeil). (E) 5B2T-Gruppe/3 Wochen, zeigt wenige schwach positive Färbungen mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma von Hepatozyten als goldbraune Körnchen (roter Pfeil). (F) 5B2T-Gruppe/6 Wochen, zeigt wenige schwach positive Färbungen mit HSA-Antikörpern im Zytoplasma von Hepatozyten als goldbraune Körnchen (roter Pfeil).

Die korrekte Aufnahme und Bindung zwischen dem Medikament und dem Rezeptor wird als molekulares Andocken bezeichnet. Die signifikanteste Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor weist die niedrigste Andockenergie auf. AutoDock Vina wurde verwendet, um die Affinität, die Konformation der Bindung und den besten Liganden zu bewerten. Für beide Liganden wurden unter mehreren Docking-Posen nur die höchsten Docking-Werte in die Studie einbezogen. Alle Daten bezüglich der Bindungskraft, der Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen und der Aminosäurebeteiligung an den Wechselwirkungen, die in TNF-α und IL-6 beobachtet wurden, sind in Tabelle 3 und den Abbildungen aufgeführt. 7 und 8.

2D- und 3D-Darstellung der Interaktion von 5B2T mit TNF-α (PDB-ID: 1TNF).

2D- und 3D-Darstellung der Interaktion von 5B2T mit IL-6 (PDB-ID: 1IL6).

5-Benzylidin-2-thiohydantoin (5B2T) bindet an TNF-α (PDB ID:1TNF) und bildet sich; Wasserstoffbrückenbindungen mit PRO A: 117, TYR C:119: 116, LYS C:98, TYR A: 119, ILE C:118 bzw. mit IL-6 (PDB ID: 1IL6) mit ARG A:169. Währenddessen wurden hydrophobe Wechselwirkungen zwischen der Bindung von 5-Benzylidin-2-thiohydantoin (5B2T) und TNF-α (PDB ID:1TNF) und IL-6 (PDB ID: 1IL6) mit PRO A:117, ILE A:118 beobachtet. ALA A:96, PRO B: 117, LEU A:166, LEU A:65 bzw. PRO A:66. Mit GLU A gebildete Pi-Anion-Wechselwirkung: 173 und zwischen 5B2T und PHE A wurde eine ungünstige Doner-Doner-Bindung beobachtet; 174 Aminosäuren in IL-6 (PDB-ID: 1IL6) (Abb. 7 und 8).

In silico wurde die Vorhersage von ADME/T und der Arzneimittelähnlichkeit von 5B2T theoretisch über admetSAR und SwissADME berechnet. Das Molekulargewicht von 204,25 (g/mol) weist akzeptable Eigenschaften im ADMET-Bereich auf. Ein signifikanter Wert von 78 % zeigte eine hohe Wahrscheinlichkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Der Prozentsatz der menschlichen intestinalen Arzneimittelabsorption lag mit 98,73 % im akzeptablen Bereich (> 80). Es wurde festgestellt, dass der Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (Log P) von 1,03 weniger als 5 beträgt, wobei nicht mehr als ein Verstoß zulässig ist. Die topologischen Flächen (TPSA) lagen im akzeptablen Bereich (< 140). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Zahl der H-Brücken-Akzeptoren (HBA) und -Donoren (HBD) im Bereich von 3–6 bzw. 2–4 liegt (Tabelle 4).

In der vorliegenden Studie haben wir (Z)-5-Benzyliden-2-thioxoimidazolidin-4-on unter Knoevenagel-Kondensationsbedingungen synthetisiert. Das 1H-NMR-Spektrum für 5B2T zeigte ein typisches Singulettsignal für den Wasserstoff an der Doppelbindung (CH=C) bei δ 6,49 ppm, und die drei aromatischen Protonen wurden bei δ 7,45–7,37 ppm als Mehrfachsignale und zwei aromatische Protonen angezeigt als Dublett bei δ7,74 ppm (d, J = 7,4 Hz, 2H, phen). Im 1H-NMR-Spektrum wurden keine Überlappungen zwischen einem typischen Signal für den Wasserstoff an der Doppelbindung und aromatischen Ringsignalen für 5B2T beobachtet. Das 13C-NMR-Spektrum zeigte kompatible Signale mit der Anzahl der in 5B2T vorhandenen Kohlenstoffe. Andererseits zeigte das 13C-NMR-Spektrum das Vorhandensein eines Stereoisomers an, das durch ein Kohlenstoffsignal jedes Kohlenstoffatoms in 5B2T dargestellt wurde. Bei Knoevenagel-Kondensationen waren bei Knoevenagel-Kondensationen geometrische E- und Z-Isomere möglich. Während das 13C-NMR-Spektrum ein Isomer von 5B2T und die Konfiguration von Z-Isomeren nahelegte, deutet dies darauf hin, dass diese Konfiguration aufgrund der geringeren sterischen Hinderung zwischen der Carbonylgruppe und dem CH = Phenylring eine größere thermodynamische Stabilität aufweist21.

DEN ist eine bekannte krebserregende Chemikalie und für viele Versuchstiere ein akutes Lebertoxin. Es wurde nachgewiesen, dass eine längere Verabreichung von DEN Lebertumoren auslöst. Eine einzelne intraperitoneale Injektion von 200 mg/kg DEN bei Versuchsnagern kann wirksam eine irreversible Leberschädigung auslösen22. Der Hauptfaktor, der es DEN ermöglicht, Leberschäden und Krebs auszulösen, ist die hohe Wahrscheinlichkeit, dass diese Substanz reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt, die zu oxidativem Stress und Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen führen. Damit DEN diese Wirkung entfalten kann, muss es zuerst durch ein körpereigenes Enzym namens Cytochrom p450 metabolisiert werden, wodurch DEN hohe Mengen an ROS produziert, die zur Lipidperoxidation der Zellmembran und zu DNA-Addukten über Alkylierung führen, was zu … Zellschäden und Verletzungen. Die erfolgreiche Verabreichung von DEN an Versuchstiere führt zu einer 100-prozentigen Induktion von hepatozellulärem Karzinom (HCC)23. In dieser Studie wurde eine einzelne intraperitoneale Injektion von 200 mg/kg DEN eingesetzt, um bei Versuchstieren/männlichen Ratten Leberschäden und Krebs auszulösen, um die hepatoprotektive Wirkung von 5B2T (einem arzneimittelähnlichen Molekül) bei der Behandlung von Lebererkrankungen zu bewerten. Die Ergebnisse der biochemischen Analyse sind in Abb. 2 dargestellt, aus der ersichtlich ist, dass die Verabreichung von DEN einen deutlichen Anstieg der biochemischen Lebermarker im Serum, einschließlich Aminotransferasen (ALT, AST und ALP), als Hinweis auf eine Lebererkrankung verursachte Schädigung und Instabilität der Leberstoffwechselaktivitäten. Dieser Anstieg kann auf die zytoplasmatische Freisetzung dieser Enzyme in den Blutkreislauf nach dem Bruch der Plasmamembran aufgrund der durch DEN24 verursachten Zellschädigung zurückgeführt werden. Alkalische Aminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST) und alkalische Phosphatase (ALP) gelten als die empfindlichsten biochemischen Biomarker im Serum für die Diagnose einer Leberfunktionsstörung25. Die orale Ergänzung von 5B2T zeigte einen starken Rückgang der Serumenzymspiegel, die zuvor durch DEN induziert wurden. Viele Studien stützten diese Ergebnisse und berichteten über die gleichen hohen Werte an biochemischen Markern der Leber während der DEN-induzierten Karzinogenese, einschließlich einer Studie, in der Knoblauchöl gegen durch DEN induziertes HCC untersucht wurde26. Dies deutet auf die Fähigkeit von 5B2T hin, das durch DEN induzierte Tumorwachstum bei Ratten zu hemmen, was möglicherweise auf die Fähigkeit der verwendeten Behandlung zurückzuführen ist, die Einheit und Integrität der Plasmamembran der Zelle zu bewahren und das Austreten dieser zytoplasmatischen Enzyme aus dem Inneren der Zelle zu verhindern die Zellen durch Membranen nach außen und entfalten hepatoprotektive Aktivitäten. Dies könnte auch der Grund dafür sein, dass die biochemischen Marker ihre Aktivität nach der Verabreichung von 5B2T wiederherstellten. Auch andere Faktoren könnten dazu beigetragen haben, einschließlich der Art des Metalls, des Liganden und seiner Donoratome. Neben der biochemischen Bewertung umfasste diese Studie auch die Bewertung der ELISA-Technik (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Essay) zur weiteren Veranschaulichung der Auswirkungen sowohl des Induktors als auch der Behandlung auf die Leber. Abbildung 3 zeigt die Wirkung von 5B2T auf die proinflammatorischen TNFα- und IL-6-Zytokinspiegel. Bei mit DEN behandelten Ratten wurde ein starker Anstieg der Serumspiegel proinflammatorischer Zytokine beobachtet, und diese Ergebnisse wurden mit Krebs und Entzündungen (insbesondere TNF-α und IL-6) in Verbindung gebracht, deren Anstieg nach der Verabreichung von DEN27 dokumentiert wurde . Im Gegensatz dazu zeigten Ratten, die mit 5B2T behandelt wurden, einen deutlichen Rückgang der Konzentrationen dieser Zytokine. TNF-α vermittelt zytotoxische Wirkungen durch die Expression von p55- und p75-Rezeptoren in seiner Molekularmasse von 55 kDa. Dadurch induziert TNF-α reaktive Sauerstoffspezies (ROS) im Nikotinamidadenindinukleotidphosphat und in den endothelialen Mitochondrien ihrer Zellmembran und stört auch die Elektronentransportkette im Mitochondrienkomplex neben der Stimulierung der Kernfaktor-Kappa-Beta-Aktivierung und der Hochregulierung der IL-6-Expression28.

Diese Ergebnisse wurden durch die histopathologischen und immunhistochemischen Verbesserungen in den getesteten Leberschnitten gestützt. Nach der Verabreichung von DEN waren die charakteristischen histologischen Merkmale der Leber verzerrt, desorganisiert und gingen verloren. Dies kann auf eine Reihe von Reaktionen zurückzuführen sein, darunter oxidativer Stress, Verlust der Zellmembranintegrität, Infiltration von Entzündungszellen und schließlich die Umwandlung normaler Hepatozyten in Tumorzellen29. Abbildung 4 zeigt die histopathologischen Ergebnisse. Mikroskopische Ergebnisse der histopathologisch getesteten Leberschnitte von DEN-behandelten Ratten in der ersten Versuchsdauer zeigten massive Entstellungen und Schäden an der Leber, die sich hauptsächlich durch Fibrose im Pfortaderbereich und Erweiterung der Sinusoide äußerten. Andererseits zeigte die 6-wöchige Dauer der DEN-Verabreichung ein schwerwiegenderes und fortgeschritteneres Stadium der Leberschädigung, das durch die Infiltration von Entzündungszellen im Bereich der Zentralvene, die Erweiterung der Gallenkanäle, Peliose und Adenome angezeigt wurde, was die langfristigen destruktiven Wirkungen unterstützt von DEN auf der Leber. Die gleichen Ergebnisse wurden in einer Studie gefunden, in der die Wirkung von Ingwer gegen DEN-induzierte Hepatotoxizität bei Ratten untersucht wurde30, was die schädlichen Auswirkungen von DEN auf die Leber stützt. Im Gegensatz dazu zeigten Leberschnitte der drei Wochen lang mit 5B2T behandelten Ratten Verbesserungen in der allgemeinen Architektur der Leber mit weniger fibrotischen und entzündlichen Zellen. Gleichzeitig zeigten Ratten, die 6 Wochen lang mit 5B2T behandelt wurden, nicht nur eine Hemmung der zerstörerischen Wirkung von DEN, sondern zeigten auch eine Wiederherstellung teilweiser bis vollständiger histologischer Merkmale in einem größeren Ausmaß als bei der ersten Behandlungsdauer. Darüber hinaus ist in den Abbildungen die immunhistochemische Bewertung von zwei leberspezifischen Hauptantikörpern, Ki-67 und HSA, dargestellt. 5 und 6. Die Placebogruppe zeigte eine negative Färbung von Ki-67 und HSA im Zellkern der getesteten Gewebezellen. Die Gewebeschnitte von mit DEN behandelten Ratten zeigten für beide Versuchsdauern eine starke positive Färbung für Ki-67- und HSA-Antikörper, was die schädlichen Auswirkungen von DEN auf Hepatozyten deutlich untermauert. In einer Studie zur Untersuchung von Ki-67 bei DEN-induziertem HCC bei Ratten wurde nach der DEN-Induktion ein signifikanter Anstieg der Anzahl Ki-67-positiver Zellen beobachtet31. Die Behandlung mit 5B2T zeigte interessante Ergebnisse, die die Prognose verbesserten, was die hohe Wirksamkeit der Chemikalie bei der Heilung eines fortgeschrittenen Stadiums einer Leberschädigung widerspiegelt. Die auf HSA getesteten Leberschnitte der nach 3 und 6 Wochen behandelten Ratten zeigten eine schwach positive Färbung im Zytoplasma der betroffenen Hepatozyten. Beim Vergleich dieser Ergebnisse mit der Ki-67-Bewertung wurden interessantere Ergebnisse gefunden, die darauf hindeuten, dass eine längere Behandlungsdauer einen direkten proportionalen Zusammenhang mit der erhöhten Wirksamkeit des Arzneimittels hat, unabhängig von der verabreichten Dosierung (d. h. mit der Stabilität der Arzneimitteldosis). . Die getesteten Schnitte der drei Wochen lang mit 5B2T behandelten Ratten zeigten wenige positiv gefärbte Kerne mit Ki-67-Abs; Im Gegensatz dazu zeigten die Ergebnisse der 6-wöchigen Behandlungsdauer eine insgesamt negative Färbung mit Ki-67 Abs. Die bekannten Heilfähigkeiten dieses einzigartigen Derivats der Thiohydantoin-Gruppe arzneimittelähnlicher Moleküle können auf den Besitz eines stereogenen Zentrums in seiner 5. Position zurückgeführt werden32. Dennoch geht man auch davon aus, dass diese chemischen Derivate des Thiohydantoins in der Lage sind, die Entzündungs- und Verletzungsrezeptoren der Leber zu blockieren und deren Expression zu hemmen. Es wird beispielsweise angenommen, dass 2-Thiohydantoin-Derivate eine wichtige Rolle bei der Hemmaktivität wichtiger Enzyme spielen, beispielsweise der Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NAPDH)-Oxidase (NOX), die eine wichtige Rolle im Krebszyklus und bei der Wirtszellumwandlung spielt Abwehr von Entzündungen sowie Zellsignalisierung und Isocitratdehydrogenase (IDH), die eine zentrale Rolle im Tricarbonsäurezyklus spielt10. Die Thiohydantoin-Gruppe ist aufgrund ihrer geringen Toxizität für menschliche Zellen weithin für ihre pharmakologischen Anwendungen als antimikrobielle Mittel und Antikrebsmittel bekannt, insbesondere als 2-Thiohydantoin-Derivate. Wie bereits erwähnt, ist das 5B2T-Derivat aufgrund seiner einfachen Herstellung und, was noch wichtiger ist, des Vorhandenseins eines stereogenen Zentrums an der fünften Position eine wertvolle und vielversprechende Option, die in Zukunft zur Behandlung von Lebererkrankungen eingesetzt werden kann33. Die höchste Bindungsstelle (− 7,1 kcal/mol) deutet auf eine starke Bindungsstellenaffinität für die 5B2T-Wechselwirkung mit TNF-α hin. 5B2T baut drei Wasserstoffbrückenbindungen mit GLU B161, GLU C: 116 und PRO100 sowie eine hydrophobe Bindung mit GLU173 auf. Die IL-6-Bindungsstelle (PDB-ID: 1IL6) und die 5B2T-Wechselwirkung haben eine signifikante Bindungsstellenenergie von -6,1 (Kcal/mol) und bilden eine Wasserstoffbindung mit SER170 und drei hydrophobe Bindungen mit LEU 65, 166 und PRO 66. Laut Lipinski und seinem Team34 erwies sich die ADMET-Analyse für 5B2T als mit der Fünferregel (RO5) für arzneimittelähnliche Moleküle vereinbar. Das Molekulargewicht beträgt < 500/gmol, was dem Referenzbereich entspricht. Der Wert der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​+ Wert beschreibt die Fähigkeit der Verbindung, die BHS zu überwinden, die im zulässigen Bereich liegt. Die topologischen Oberflächen (TPSA), log p, H-Brücken-Akzeptoren (HBA) und Donoren (HBD) lagen im akzeptablen Bereich. Die Werte zeigen, dass 5B2T vom menschlichen Darm aufgenommen werden kann und eine ungiftige und nicht krebserregende Verbindung ist. Alle Werte zeigten, dass 5B2T die Regeln von Lipinskis Fünferregel (Ro5) und Veber, 4, erfüllt. Die vielversprechenden Ergebnisse für 5B2T deuten darauf hin, dass sie als Medikamentenkandidaten eingesetzt werden können. In dieser Studie wurde eine einzelne intraperitoneale Injektion von 200 mg/kg DEN eingesetzt, um bei Versuchstieren/männlichen Wistar-Ratten Leberschäden und Krebs auszulösen, um die hepatoprotektiven Wirkungen der Chemikalie 5-Benzylidin-2-thiohydantoin (medikamentenähnlich) zu bewerten Molekül) bei der Behandlung von Lebererkrankungen, Abb. 9 fasst das Experiment zusammen. Die Verabreichung von 10 % Tween 80 % galt als Kontrolle der Studie. Mit DEN behandelte Ratten verursachten eine massive Leberschädigung, die insbesondere zu einem Anstieg der biochemischen Marker der Leber (Gesamtbilirubin, direktes Bilirubin, indirektes Bilirubin, Alaninaminotransferase, Aspartataminotransferase und alkalische Phosphatase) sowie zu einem Anstieg entzündungsfördernder Zytokine (Tumornekrosefaktor-Alpha) führte und Interleukin-6) und ein festgestellter hoher Spiegel an HAS- und Ki-67-Antikörpern führten schließlich zum Verlust der Leberarchitektur. Mit 5-Benzylidin-2-thiohydantoin behandelte Ratten stellten die Leberfunktionen und -architektur deutlich wieder her, was sich in der Abnahme derselben Lebermarker widerspiegelte. Diese Ergebnisse untermauern nachdrücklich die therapeutischen Eigenschaften der Behandlung und ihre vielversprechenden hepatoprotektiven Aktivitäten.

Die Wirkung von 5-Benzylidin-2-thiohydantoin auf durch Diethylnitrosamin induzierte Leberschäden. DEN: Diethylnitrosamin, TNFα: Tumornekrosefaktor Alpha und IL-6: Interleukin 6. TB: Gesamtbilirubin, DB: direktes Bilirubin, AST: Acetataminotransferase, ALT: Alaninaminotransferase, ALP: alkalische Phosphatase.

Experimentell konnte die synthetisierte Chemikalie (5-Benzylidin-2-thiohydantoin) eindeutig heilende Eigenschaften gegen induzierte Leberschäden nachweisen, die durch biochemische Lebermarker, proinflammatorische Zytokine (TNF-α und IL-6) und immunhistochemische Befunde dargestellt werden. Auch molekulare Docking-Ergebnisse zeigten eine starke Bindung mit hoher Energie an verschiedenen Stellen zwischen dem 5-Benzylidin-2-thiohydantoin und entzündungsfördernden Zytokinen, was die Wirksamkeit der Chemikalie bei der Leberbehandlung belegt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Lana S. Akree & Zahra A. Amin

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, College of Pharmacy, Hawler Medical University, Erbīl, 44001, Irak

Hiwa O. Ahmad

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HO hat die Chemikalie vorbereitet, LA führt den Tierversuch durch, LA und ZA analysieren die Daten, LA hat das Manuskript geschrieben, ZA und HO überarbeiten das Manuskript.

Korrespondenz mit Zahra A. Amin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Akree, LS, Amin, ZA & Ahmad, HO In silico und in vivo hepatoprotektive Aktivität des synthetisierten 5-Benzyliden-2-thiohydantoins gegen Diethylnitrosamin-induzierte Leberschäden in einem Rattenmodell. Sci Rep 13, 4681 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27725-x

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Eingegangen: 16. Juni 2022

Angenommen: 06. Januar 2023

Veröffentlicht: 22. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27725-x

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